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康奈尔大学利用CRISPR

时间:2019-12-02 08:56:58 出处:贵州快3平台-河北快3娱乐平台_湖北快3官网平台

2019年8月5日,美国康奈尔大学的Shu-Bing Qian团队在Nature Chemical Biology上发表了题为 Programmable RNA N6-methyladenosine editing by CRISPR-Cas9 conjugates 的文章,报道了在RNA上进行m6A修饰的写入和擦除的新工具,通过融合CRISPR-dCas9和m6A甲基转移酶实现对mRNA的3’UTR和5’UTR区域的单个位点的m6A特异性写入;通过融合CRISPR-dCas9和ALKBH5或FTO实现对RNA位点特异性的去甲基化。

社会社会形态分析显示甲基转移酶中METTL3是催化核心,METTL14是RNA结合平台。METTL3-METTL14异源二聚体具备强烈的催化活性。研究人员构建了M3M14-dCas9和催化核心失活的M3D395AM14-dCas9融合蛋白,在人源HEK293T和鼠源MEF中表达,发现另5个 融合蛋白主要定位在细胞质中,与内源的METTL3、METTL14定位在细胞核中不同。我我觉得生理上m6A修饰写入趋于稳定在新生RNA(nascent RNAs)转录过程中,但细胞质内的m6A写入工具为研究心智心智心智心智开花结果期是什么是什么图片 图片 期期RNA的de novo甲基化功能提供了可是我。与DNA靶向dCas9例如,sgRNA和PAMer社会形态对于M3M14-dCas9与靶标RNA结合是必需的。研究人员首先选着Hsp70(Hspa1a)mRNA的5’UTR检测M3M14-dCas9是是是不是不不可以写入m6A修饰。在基本不表达Hspa1a的MEF细胞中引入携带Hspa1a 5’UTR的荧光素酶报告系统,检测发现在5’UTR的A103位点有本底性m6A修饰。引入M3M14-dCas9和sgRNA、PAMer意味着A103位点的m6A增加,可是我m6A的写入具有位点特异性(在A123000没法 m6A增加)和甲基化酶催化活性依赖(M3D395AM14-dCas9不到增加A103的m6A)。5’UTR对核糖体扫描(ribosome scanning)非常重要。可是我的研究表明CRISPR-Cas9靶向5’UTR或编码区可是我抑制mRNA翻译过程,而检测发现单独表达sgRNA或PAMer,抑或是与M3M14-dCas9共表达均不影响核糖体扫描过程。相反,在应激条件下,5’UTR甲基化意味着Fluc活性增加,而mRNA水平不变,即当帽子依赖性的转录机制被抑制时,5’UTR m6A有利于非经典的转录过程。同去5’UTR m6A对mRNA的降解和半衰期没法 影响。可是我,研究显示3’UTR m6A修饰的增加,显著降低mRNA的半衰期。

FTO和ALKBH5是m6A去甲基化酶,依靠识别m6A的构象上标志发挥作用。研究人员分别构建了ALKBH5-dCas9、FTO-dCas9以及相应失活突变体,表达后发现融合蛋白主要定趋于稳定细胞核内,可是我没法 改变整体的m6A情况表。Malat1是细胞含高量富有的lnc-RNA,在A2577位点具有高程度的甲基化。研究人员利用sgRNA靶向A2577位点,ALKBH5-dCas9、FTO-dCas9显著降低甲基化。这俩 去甲基化具有酶活性依赖和位点特异性。并证明A2577位点的m6A有利于Malat1的U-tract与HNRNPC蛋白结合,而去甲基化意味着HNRNPC蛋白的解离。可是我m6A编辑不不可以重塑RNA的社会形态,调控RNA和RNA结合蛋白之间的相互作用。

总之,研究发展了位点特异性的m6A写入和擦除工具,在不改变核苷酸序列和整体m6A情况表的情况表下对RNA甲基化进行编辑,为研究表观转录组学提供了新工具。

研究背景

真核细胞中,m6A是最多的RNA修饰形式。核心亚基METTL3、METTL14、WTAP和可是我 蛋白KIAA1429、RBM15组成甲基转移酶,即m6A‘writer’,识别序列RRACH,催化形成m6A。FTO、ALKBH5介导m6A的去甲基化。m6A的功能性研究目前可是我取得巨大的进步,可是我mRNA特定位点甲基化的功能还不清楚。实际上,m6A在mRNA上的分布未必均匀,大帕累托图的甲基化集中在终止密码互近,在5’UTR和起始密码子全是m6A的峰。对于m6A的研究主要基于对修饰酶的干扰,意味着对整体RNA甲基化的影响;可是我对甲基化位点进行突变研究m6A的区域性功能,但核苷酸序列的改变可是我引入无法预期的社会形态,使数据的解读变得繁复。目前的研究工具不到区分单个的m6A修饰的功能。

CRISPR-Cas9技术发展没法快,可是我实现精确的基因组编辑功能,包括靶向的DNA切割/修复、直接的碱基编辑以及位点特异的表观基因组编辑。通过将催化部位失活的Cas9(dCas9)与DNA或组蛋白修饰酶融合,gRNA招募Cas蛋白到特异的位点,实现表观基因组的编辑。同样的思路,可是我将RNA碱基修饰酶与Cas蛋白相融合,或许将实现位点特异的RNA修饰编辑。

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